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精細(xì)化分析外周血免疫細(xì)胞亞群應(yīng)用方案

Phase.1 局限

免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)面臨窘境

人體免疫系統(tǒng)在抵御外來(lái)侵害，監(jiān)視異常細(xì)胞，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演著至關(guān)重要的角色?；谶@一核心功能，免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)在評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)，輔助篩查和評(píng)價(jià)多種良惡性疾病及其并發(fā)癥，以及健康管理等方面，也都發(fā)揮著不可或缺的作用。

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multi-parameter flow cytometry，MFC）是免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)，評(píng)估免疫功能的關(guān)鍵技術(shù)。然而，隨著近年來(lái)臨床對(duì)疾病監(jiān)測(cè)需求的增加，傳統(tǒng)的TBNK檢測(cè)——僅檢測(cè)T、B、NK細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù)，由于檢測(cè)細(xì)胞群體少，功能評(píng)估簡(jiǎn)單，所能反映的免疫細(xì)胞信息并不全面，其臨床應(yīng)用的實(shí)際效果與預(yù)期相差甚遠(yuǎn)。

Phase.2 破局

精細(xì)化分析免疫細(xì)胞亞群共識(shí)發(fā)布

為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，2023年發(fā)布了《基于多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)精細(xì)化分析外周血免疫細(xì)胞亞群的中國(guó)專家共識(shí)》^【1】（以下簡(jiǎn)稱“共識(shí)”），為免疫細(xì)胞功能檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)了重大的概念更新和擴(kuò)展：

共識(shí)建議將原先的T、B、NK淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等常見(jiàn)免疫細(xì)胞，以及使用不同標(biāo)志物組合進(jìn)一步檢測(cè)的特征性和功能性常見(jiàn)基礎(chǔ)細(xì)胞亞群重新定義為“外周血基礎(chǔ)免疫細(xì)胞亞群”；^【2】

同時(shí)，建議在傳統(tǒng)TBNK免疫細(xì)胞亞群的基礎(chǔ)上，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）等各類免疫細(xì)胞，以及檢測(cè)其分化發(fā)育、功能性和活化狀態(tài)相關(guān)標(biāo)志物，并進(jìn)一步分類出來(lái)的免疫細(xì)胞亞群，定義為“精細(xì)化分析外周血免疫細(xì)胞亞群”。^【3-5】

多參數(shù)精細(xì)化分析免疫細(xì)胞亞群為臨床檢測(cè)增加了更多參數(shù)，獲得了更多細(xì)胞亞群的信息，在淋巴瘤、腫瘤前驅(qū)病變篩查，部分遺傳和免疫缺陷性疾病診斷，良惡性疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估，免疫治療和造血干細(xì)胞抑制免疫重建中，均發(fā)揮了極其重要的作用。

Phase.3 前行

層浪流式&精細(xì)化免疫細(xì)胞亞群8色方案

共識(shí)9^【1】提出，精細(xì)化分析免疫細(xì)胞亞群建議由8色MFC管完成，其精細(xì)化程度與方案根據(jù)臨床應(yīng)用需求選擇?？梢圆捎枚喙?色及以上方案或一管超多色方案，精細(xì)化亞群比例分別為占上一層亞群的比例。我們依照共識(shí)建議的8色多管組合方案中的方案1（表2），使用層浪LongCyte^TM臨床型流式細(xì)胞儀進(jìn)行了精細(xì)化免疫細(xì)胞亞群8色分析，結(jié)果如下：

T細(xì)胞管

t細(xì)胞.png

設(shè)門策略：

依次設(shè)置單個(gè)細(xì)胞門（single），活細(xì)胞門（live），live門內(nèi)設(shè)置T細(xì)胞（T cell）門。T cell門內(nèi)設(shè)置CD4+T（T4）、CD8+T（T8）、CD4+CD8+T細(xì)胞（DP）細(xì)胞門。T、T4、T8細(xì)胞中分別CD28+、CD28-細(xì)胞群。T、T4、T8、DP中分別設(shè)置HLA-DR+CD38^-（DR+38-）、HLA-DR-CD38+（DR-38+）、HLA-DR+CD38+（DR+38+）、HLA-DR-CD38-（DR-38-）細(xì)胞群。T8中設(shè)置初始 T 細(xì)胞（TN ）、中央記憶T 細(xì)胞（TCM）、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（TEM）、終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEMRA）亞群。

Treg/Th細(xì)胞管

treg th管.png

設(shè)門策略：

依次設(shè)置單個(gè)細(xì)胞門（single）、活細(xì)胞門（live）、T細(xì)胞門（T cell）、CD4+T細(xì)胞門（T4）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞門（Treg），T4、Treg中分析初始 T 細(xì)胞（TN ）、中央記憶T 細(xì)胞（TCM）、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（TEM）、終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEMRA）。T4、TCM、TEM中進(jìn)一步分析輔助性T細(xì)胞（Th）亞群。

DC/單核/NK管

tcr管.png

設(shè)門策略：

依次設(shè)置單個(gè)細(xì)胞門（single）、活細(xì)胞門（live）、T細(xì)胞門（T cell）、αβT細(xì)胞門（αβT）、γδT細(xì)胞門（γδT）、NK細(xì)胞門，αβT細(xì)胞中設(shè)置CD8⁺T細(xì)胞（αβT T8）和TRBC1⁺細(xì)胞門（αβT TRBC1⁺），γδT細(xì)胞中設(shè)置TCR Vδ2陽(yáng)性細(xì)胞門（γδT Vδ2）。分析上述各群細(xì)胞的CD57⁺、CD279⁺、CD57⁺CD279⁺細(xì)胞群，分析γδT和TCRVδ2細(xì)胞的CD56⁺、CD56⁺CD57⁺細(xì)胞群。

TCR管

dc單核.png

設(shè)門策略：

依次設(shè)置單個(gè)細(xì)胞門（single）、活細(xì)胞門（live）、單個(gè)核細(xì)胞門（PBMC）、非T非B細(xì)胞門（CD3^-CD19^-），非T非B細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置NK、單核細(xì)胞（monocyte）、系別陰性（lin^-）細(xì)胞門，NK細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置CD56和CD16組合表達(dá)亞群，單核細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置經(jīng)典單核細(xì)胞（Mo1）、中間單核細(xì)胞（Mo2）、非經(jīng)典單核細(xì)胞（Mo3）亞群，lin-細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置樹(shù)突狀細(xì)胞門（DC），DC內(nèi)區(qū)分漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDC）和髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）。

B細(xì)胞管

b細(xì)胞.png

設(shè)門策略：

依次設(shè)置單個(gè)細(xì)胞門（single）、活細(xì)胞門（live）、單個(gè)核細(xì)胞門（PBMC）、B 細(xì)胞門（B cell）、漿細(xì)胞（plasma cell）門，B細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置 CD27^-B 細(xì)胞門、記憶性B細(xì)胞門（memory B）、CD5⁺B細(xì)胞門，分析B和CD5⁺B 細(xì)胞門內(nèi)kappa、lambda表達(dá)，CD27^-B細(xì)胞內(nèi)分析初始B前細(xì)胞（pre naiveB）和過(guò)渡階段B細(xì)胞（transitional B），memory B中分析漿母細(xì)胞（plasmablast）。

使用儀器

層浪生物L(fēng)ongCyte^TM3光14色流式細(xì)胞儀

參考文獻(xiàn)：

【1】基于多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)精細(xì)化分析外周血免疫細(xì)胞亞群的中國(guó)專家共識(shí).中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 2023 年11 月第 57 卷第 11 期

【2】中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. WS/T 3602011流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

【3】Paul F Ruhle,Rainer Fietkau,etal.Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.Int J Mol Sci.2016 Aug 11;17(8):1316.doi: 10.3390/ijms17081316.

【4】Greg Finak,Marc Langweiler,etal.Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat Rev Immunol.2012 Feb 17;12(3):191-200. doi: 10.1038/nri3158.

【5】Oras A,Quirant Sanchez B,etal.Comprehensive flow cytometric reference intervals ofleukocyte subsets from six study centers across Europe.Clin Exp Immunol. 2020 Dec;202(3):363-378.doi: 10.1111/cei.13491.