流式細(xì)胞術(shù)做為一種快速的細(xì)胞定量分析技術(shù)，能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多種特征參數(shù)的檢測(cè)，如細(xì)胞大小、DNA含量、蛋白質(zhì)表達(dá)等，現(xiàn)已成為科研領(lǐng)域中不可或缺的重要工具。

而流式檢測(cè)能順利進(jìn)行的硬要求之一是，樣本必須能在鞘液中流動(dòng)，因此，無論是培養(yǎng)的細(xì)胞，還是從各種組織中提取出來的細(xì)胞，都需要把待測(cè)樣本制備成單細(xì)胞懸液！制備欠妥的樣本，不僅會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和結(jié)果的可靠性，一些大的細(xì)胞團(tuán)塊甚至?xí)氯毫飨到y(tǒng)而影響儀器的正常運(yùn)行。

層浪技術(shù)寶典第二期，為更好地掌握流式檢測(cè)的樣本制備環(huán)節(jié)，給大家?guī)砹?/span>小鼠淋巴組織單細(xì)胞懸液制備的全流程。希望你不管是實(shí)驗(yàn)“小白”還是有經(jīng)驗(yàn)的研究者，都可以能從中受益，輕松搞定實(shí)驗(yàn)！

Phase.1 實(shí)驗(yàn)過程

1取脾臟：

①頸椎脫臼法處死小鼠（圖A）；在解剖臺(tái)上固定小鼠，從底端小心剪開小鼠整個(gè)腹部皮膚，暴露出小鼠腹膜（圖B）；

②剪開小鼠腹膜，暴露出脾臟，摘取，并充分去除上面的脂肪組織（圖C、圖D）；

③將取下的脾臟置于預(yù)冷的PBS中浸泡待用。

2研磨制備單細(xì)胞：

將脾臟置于在70μm篩網(wǎng)上，使用研磨棒輕柔碾碎脾臟組織，脾臟細(xì)胞和紅細(xì)胞通過篩網(wǎng)過濾至PBS中；脾臟充分研磨之后，收集篩網(wǎng)下端溶液至50mL離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

3裂解紅細(xì)胞：

①在離心后的細(xì)胞懸液中加入1mL ACK紅細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞，在室溫裂解5min；

②裂解結(jié)束后，加入5mL 含2% FCS的RPMI培養(yǎng)基終止裂解，渦旋混勻；

4過濾、洗滌：

通過70μm過濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液收集至離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

5單細(xì)胞計(jì)數(shù)：

使用染色緩沖液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1*107/mL，吸取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，準(zhǔn)備染色。

注意事項(xiàng)：

1.研磨力度盡量輕柔，避免造成過多機(jī)械性死亡的細(xì)胞；

2.摘取脾臟后，盡可能移除黏連的脂肪組織，提高脾臟細(xì)胞的占比；

3.建議使用新鮮配制的紅細(xì)胞裂解液。

Phase.2 流式結(jié)果

小鼠脾臟中Th17細(xì)胞檢測(cè)分析：

① 通過FSC-H/SSC-H圈出淋巴細(xì)胞主群（圖A）；

② 通過CD3圈出總的T細(xì)胞：CD3+（圖B）；

③ 通過CD4/CD8圈出殺傷性T細(xì)胞（TCL）：CD3+CD4-CD8+；輔助性T細(xì)胞（Th）：CD3+CD4+CD8-（圖C）；

④ 在Th細(xì)胞群中，進(jìn)一步圈出Th17細(xì)胞：CD3+CD4+CD8-IL-17A+（圖D）。

Phase.1 實(shí)驗(yàn)過程

1取淋巴結(jié)：

① 頸椎脫臼法處死小鼠（圖A）；在解剖臺(tái)上固定小鼠，從底端四肢剪開皮膚，小心剪開小鼠整個(gè)腹部皮膚，暴露出小鼠腹膜（圖B）；

② 小鼠淋巴結(jié)主要分布在：腹股溝左右兩側(cè)（圖C）、腋窩（上箭頭）和肱（下箭頭）淋巴結(jié)的位置（圖D）；下頜骨（上方箭頭）、腋窩（中間箭頭）和臂部（底部箭頭）淋巴結(jié)的位置（圖E）；左側(cè)淋巴結(jié)位置在圖示箭頭處（圖F），摘取下來淋巴結(jié)如圖G所示；

③ 將取下的淋巴結(jié)置于預(yù)冷的PBS中浸泡待用；

2研磨制備單細(xì)胞：

將淋巴結(jié)置于在70μm篩網(wǎng)上，使用研磨棒輕柔碾碎，淋巴結(jié)細(xì)胞通過篩網(wǎng)過濾至PBS中；淋巴結(jié)充分研磨之后，收集篩網(wǎng)下端溶液至50mL 離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

3過濾、洗滌：

通過70μm過濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液收集至離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

4單細(xì)胞計(jì)數(shù)：

使用染色緩沖液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1*107/mL，吸取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，準(zhǔn)備染色。

注意事項(xiàng)：

1.研磨力度盡量輕柔，避免造成過多機(jī)械性死亡的細(xì)胞；

2.摘取淋巴結(jié)后，盡可能移除黏連的脂肪組織，提高淋巴結(jié)細(xì)胞的占比。

Phase.2 流式結(jié)果

小鼠淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞檢測(cè)分析：

①通過FSC-A/SSC-A圈出淋巴細(xì)胞主群（圖A.R1）；

②用FCS-A/FCS-H去除粘連體信號(hào)，分析單細(xì)胞（圖A.R2）

③圈出活性的T細(xì)胞：LD/B220-CD3+（圖A.R3 ），在T細(xì)胞中圈出CD3+CD4+的細(xì)胞群（圖A.R4）；

④通過共表達(dá)高水平的CXCR5和PD1來鑒定Tfh細(xì)胞（圖B）；

⑤Tfh細(xì)胞高表達(dá)CD44和CXCR5（圖C.左），并且轉(zhuǎn)錄因子Bcl6高表達(dá)（圖C.右）。

Phase.1 實(shí)驗(yàn)過程

1取胸腺：

① 頸椎脫臼法處死小鼠，在解剖臺(tái)上固定小鼠（圖A）；小心剪開小鼠整個(gè)腹部皮膚，暴露出小鼠腹膜（圖B）；

② 切除腹壁；小心地切開隔膜（如箭頭所示），而不損傷血管、肝臟或膽囊（圖C）；

③ 在不損害血管、肝臟、肺或心臟的情況下切除胸腔，暴露胸腺；胸腺用箭頭標(biāo)記（圖D）；

④ 將胸腺置于預(yù)冷的PBS中浸泡待用；

2研磨制備單細(xì)胞：

將胸腺置于在70μm篩網(wǎng)上，使用研磨棒輕柔碾碎，胸腺細(xì)胞通過篩網(wǎng)過濾至PBS中；胸腺充分研磨之后，收集篩網(wǎng)下端溶液至50mL 離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

3過濾、洗滌：

通過70μm過濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液收集至離心管中，在4℃條件下，300g離心5min，去除上清液；

4單細(xì)胞計(jì)數(shù)：

使用染色緩沖液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1*107/mL，吸取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，準(zhǔn)備染色。

注意事項(xiàng)：

1.研磨力度盡量輕柔，避免造成過多機(jī)械性死亡的細(xì)胞；

2.摘取胸腺后，盡可能移除黏連的脂肪組織，提高胸腺細(xì)胞的占比；

3.摘取過程中，避免手術(shù)器械破壞胸腺附近的血管；若胸腺上有大量血液殘留，可用PBS沖洗1-2次后再進(jìn)行單細(xì)胞懸液制備。

Phase.2 流式結(jié)果

小鼠胸腺中Treg細(xì)胞檢測(cè)分析：

①通過FSC/SSC特性圈出淋巴細(xì)胞（G0）(圖A)；

②在淋巴細(xì)胞群（G0）中，通過FSC-A/FSC-H(圖B)和SSC-A/SSC-W（圖C）排除粘連體；使用死活染料圈出活細(xì)胞群體（G3）（圖D）；

③在活細(xì)胞中，圈出CD4+CD8-細(xì)胞群（圖E.G4）；隨后展示FOXP3和CD25表達(dá)情況，區(qū)分兩群Treg前體細(xì)胞（圖F.G5&G6）和Treg細(xì)胞（圖F.G7）；

④胸腺Treg細(xì)胞可分為CD24highCD69+的未成熟細(xì)胞（圖G.G9）；和CD24dim/lowCD69-的成熟細(xì)胞（圖G.G8）；

⑤CD4SP細(xì)胞也可分為CD24highCD69+的未成熟細(xì)胞（圖H.G10）和CD24dim/lowCD69-的成熟細(xì)胞（圖H.G11）。