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細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的、有序的死亡。細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡不同，細(xì)胞壞死是指細(xì)胞的被動死亡，通常是細(xì)胞受到物理、化學(xué)等環(huán)境因素的影響，如機(jī)械損傷、毒物、微生物等影響，引起的細(xì)胞的病理性死亡。

Annexin V是最經(jīng)典的檢測細(xì)胞凋亡的方法，檢測原理如下圖所示。細(xì)胞凋亡時形態(tài)學(xué)特征會發(fā)生一系列的變化，其中磷脂酰絲氨酸（PS）的變化是凋亡最顯著的的特征之一。在正常細(xì)胞中，PS一般分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡的過程中，PS殘余物會由脂膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面。Annexin V可以特異性的與細(xì)胞表面的PS發(fā)生結(jié)合，但早期、晚期和壞死的細(xì)胞均有PS外翻的現(xiàn)象，因此在凋亡的檢測過程中常搭配PI或7-AAD（核酸染料）來區(qū)別細(xì)胞早期凋亡和壞死的細(xì)胞，PI或7-AAD不能進(jìn)去正常和早期凋亡的細(xì)胞與核酸結(jié)合，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過程，質(zhì)膜對PI和7-AAD的通透性增加，在細(xì)胞晚凋或壞死階段可進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，標(biāo)記上紅色熒光。

圖1.凋亡檢測原理圖

圖2. LongCyte 3光14色凋亡數(shù)據(jù)

1. 收集單細(xì)胞懸液：不同細(xì)胞類型具體制備單細(xì)胞懸液的方法不同，懸浮細(xì)胞直接進(jìn)入第2步。貼壁和半貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化，然后1500-2000 rpm離心5 min，棄上清；

2. 清洗：將離心收集的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗1-2次，1500-2000 rpm離心5 min，棄上清，充分去除殘留的FBS和胰酶；

3. 調(diào)整細(xì)胞濃度：加入 1× Binding Buffer，調(diào)整細(xì)胞濃度一般為0.2- 1×107/mL；

4. 染色：取100-200 ul懸液于流式管中，加入適量標(biāo)記了熒光染料的 Annexin V和適量PI/7-AAD，輕輕混勻；室溫避光孵育 15-20 min；

5. 上機(jī)：再加入300 μl PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)（建議1 小時內(nèi)完成檢測）。

Annexin V與PS的結(jié)合依賴于鈣離子的存在，因此在消化貼壁細(xì)胞時，要使用不含EDTA的胰酶，并且在標(biāo)記時確保使用含鈣離子的緩沖液。

Annexin V與PS的結(jié)合是可逆的，而且不容易被固定，需要在標(biāo)記結(jié)束后1-3小時內(nèi)必須進(jìn)行上機(jī)檢測；另外，PI是核酸類染料，也需要盡快上機(jī)，減少細(xì)胞的黏連。

一定要設(shè)置合適的對照。一些細(xì)胞類型如巨核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和血小板細(xì)胞表面存在大量磷脂酰絲氨酸，因此要設(shè)置合適的對照組，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

PI核酸類的染料容易黏連，上樣前可以過濾去除大的細(xì)胞團(tuán)，另外需要盡快上機(jī)減少黏連的信號，收集數(shù)據(jù)以后，A和H（或者A和W）去除黏連信號。

除了用Annexin V FITC和PI檢測細(xì)胞的凋亡，死活染料也可以用7-AAD，JC探針、MitoSpyTM探針、伯胺類染料等。檢測細(xì)胞凋亡的方案那么多，哪一種是最適合您的樣本的呢？讓我們一起來用層浪的流式儀解鎖更多細(xì)胞凋亡檢測方案吧。