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乳酸菌（lactic acid bacteria）：一類通過(guò)發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，因其能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸而得名。常見(jiàn)的乳酸菌屬有乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬等。
（圖片源自網(wǎng)絡(luò)）
乳酸菌：
身份多變的“全能大師”
??食品界的“明星”：酸奶、乳酪、泡菜、酸菜，這些美味的食品都有乳酸菌的身影，它們用發(fā)酵的魔法提升了食品的味道和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳酸菌不僅讓食物更美味，還常用于乳制品的質(zhì)量認(rèn)證和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
??生物醫(yī)藥界的“配送員”：乳酸菌作為藥物傳遞載體，既安全又高效，適用于口服、鼻飼和陰道給藥等方式，廣泛應(yīng)用于治療黏膜感染、炎癥性腸病、腫瘤及疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。它們不僅能為我們傳遞治療藥物，還能生產(chǎn)胰島素、疫苗等生物藥物。
??健康領(lǐng)域的“偵探長(zhǎng)”：乳酸菌在腸道健康方面的表現(xiàn)可謂“功勛卓著”。通過(guò)檢測(cè)腸道菌株的豐度和分布，可以評(píng)估乳酸菌攝入對(duì)腸道微生物群落的影響。將腸道微生物組學(xué)與蛋白組學(xué)相結(jié)合，可以更深入地探索它與各種疾病之間的關(guān)聯(lián)。
??畜牧農(nóng)業(yè)中的“衛(wèi)士”：乳酸菌發(fā)酵可用于制作畜牧養(yǎng)殖的優(yōu)秀飼料，也可通過(guò)檢測(cè)乳酸菌種類來(lái)優(yōu)化肥料配方。此外，通過(guò)檢測(cè)土壤中乳酸菌的存活率和定植能力還可以用于評(píng)估生物肥料對(duì)農(nóng)作物的有效性。
??環(huán)境領(lǐng)域的“清潔工”：乳酸菌在污水處理、生態(tài)修復(fù)方面也有著出色的表現(xiàn)，它們通過(guò)調(diào)節(jié)水體和土壤中的生態(tài)環(huán)境，幫助修復(fù)被污染的生態(tài)系統(tǒng)。也可通過(guò)水體或土壤中乳酸菌種類及其濃度來(lái)評(píng)估環(huán)境生態(tài)的變化。
??化妝品界的“研發(fā)師”：乳酸菌發(fā)酵物在化妝品中有保濕、抗炎、修復(fù)等多種功能，通過(guò)監(jiān)測(cè)其活性可評(píng)估化妝品功效并優(yōu)化配方。
流式細(xì)胞儀：
乳酸菌研究中的“超能利器”
通過(guò)特定的熒光染料對(duì)乳酸菌進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀能夠區(qū)分活菌與死菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。這種方法快速、準(zhǔn)確，避免了傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法可能存在的低估細(xì)菌數(shù)量、無(wú)法檢測(cè)不形成菌落的細(xì)菌等問(wèn)題。
乳酸菌飲料及發(fā)酵食物的質(zhì)量控制：
通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)品中乳酸菌的數(shù)量，可以評(píng)估產(chǎn)品的品質(zhì)，判斷保質(zhì)期，確認(rèn)是否有雜菌污染。
乳酸菌自溶檢測(cè)：
乳酸菌自溶會(huì)釋放出胞內(nèi)物質(zhì)，這可能會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，如產(chǎn)生異味、改變質(zhì)地等。流式細(xì)胞儀可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞完整性等指標(biāo)來(lái)判斷乳酸菌是否發(fā)生自溶，為控制發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。
乳酸菌的篩選與鑒定：
結(jié)合不同的熒光標(biāo)記技術(shù)和檢測(cè)參數(shù)，可以對(duì)乳酸菌進(jìn)行更準(zhǔn)確的鑒定，區(qū)分不同種類或菌株的乳酸菌，這對(duì)于研究乳酸菌的多樣性和功能特性具有重要意義。
研究乳酸菌與其他微生物的相互作用：
對(duì)乳酸菌和其他微生物進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)，從而研究它們之間的相互作用關(guān)系。例如，在混合發(fā)酵體系中，乳酸菌與酵母菌可能存在共生或競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，流式細(xì)胞儀能夠通過(guò)分析它們的數(shù)量、活力以及相互之間的接觸情況等，深入探究這種相互作用的機(jī)制。
流式細(xì)胞儀用于乳酸菌死活計(jì)數(shù)是其目前最為廣泛的用途之一，有關(guān)這部分的詳細(xì)情報(bào)，讓我們一起來(lái)看看吧。
傳統(tǒng)上，平板培養(yǎng)法計(jì)數(shù)一直是乳酸菌死活計(jì)數(shù)的經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的方法。然而，近年來(lái)，流式細(xì)胞儀正逐步取代平板培養(yǎng)法成為新的首選方法，這得益于其多方面的優(yōu)勢(shì)：
· 高靈敏度：確保了計(jì)數(shù)的精準(zhǔn)性
· 高效省時(shí)：短耗時(shí)提升了實(shí)驗(yàn)效率
· 穩(wěn)定可靠：結(jié)果的高度穩(wěn)定性與良好的重復(fù)性保障了數(shù)據(jù)的可靠性
· 多維分析：可有效區(qū)分活性細(xì)胞與總細(xì)胞，進(jìn)一步豐富了分析維度
· 高通量：高通量分析能力極大地促進(jìn)了大規(guī)模樣本的快速處理
圖1：流式細(xì)胞儀和平板培養(yǎng)法在乳酸菌死活計(jì)數(shù)工作中整體對(duì)比
圖2：流式細(xì)胞儀和平板培養(yǎng)法在乳酸菌死活計(jì)數(shù)工作流程的對(duì)比
圖3(左)：流式細(xì)胞儀和平板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性比較
圖4(右)：流式細(xì)胞儀和平板計(jì)數(shù)相關(guān)性
圖3和圖4引自《流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)水中細(xì)菌總數(shù)的方法研究》,DOI：10.19965/j.cnki.iwt.2021-0892。
方法1：CFPA+PI染色法
??實(shí)驗(yàn)原理：CFDA是一種非熒光性的化合物，具有細(xì)胞膜通透性。進(jìn)入細(xì)胞后，它被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成具綠色熒光性的產(chǎn)物。這種熒光性產(chǎn)物生成僅限于代謝活性正常的細(xì)胞，且因不易穿透活細(xì)胞膜被限制在細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合使用PI（不能穿透活細(xì)胞膜但可以穿透死細(xì)胞膜），利用兩者對(duì)細(xì)胞膜完整性差異所導(dǎo)致的通透性不同，我們可以使用流式的FITC通道有效地鑒別活細(xì)胞與死細(xì)胞。
??實(shí)驗(yàn)流程：
圖5：cFDA PI染色法操作流程圖
??實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
圖6：流式細(xì)胞分析圖譜中活性和非活性細(xì)菌區(qū)分
雙歧桿菌菌液培養(yǎng)物暴露于0%、0.05%、0.1%、0.2%或0.25%膽汁鹽，同時(shí)用cFDA和PI染色。細(xì)胞分為4群：cFDA+PI-為活細(xì)菌，cFDA+PI+為受損的細(xì)菌，cFDA-PI+為死細(xì)菌，cFDA-PI-為雜質(zhì)或碎片。
方法2：SYTO+PI染色法
??實(shí)驗(yàn)原理：SYTO是一種核酸染料，具有胞膜通透性，可以穿過(guò)活細(xì)胞和死細(xì)胞膜，并與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，可用用FITC通道檢測(cè)。而PI只能通過(guò)受損或死細(xì)胞的膜。當(dāng)胞膜受損時(shí)候，SYTO和PI同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，并展開(kāi)對(duì)DNA的競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，這一過(guò)程會(huì)削弱原本由SYTO產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度。因此，具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，而細(xì)胞膜受損的細(xì)胞則呈現(xiàn)紅色。通過(guò)觀察熒光信號(hào)的顏色變化，我們可以對(duì)細(xì)胞的活性狀態(tài)做出判斷。
??實(shí)驗(yàn)流程：
圖7：SYTO PI染色法操作流程圖
??實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
A:
B:
圖8：利用Syto9和PI染料檢測(cè)細(xì)菌死活
（使用儀器——層浪Fongcyte流式細(xì)胞儀）
A：排除背景噪音/雜質(zhì)，圈出 FSC和SSC較大的群落，為細(xì)菌主群；B：SYTO和PI雙染，綠色熒光區(qū)域?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整的顆粒即活菌，而紅色熒光區(qū)域?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損的細(xì)菌即死菌，右上角的細(xì)菌為過(guò)渡狀態(tài)的細(xì)菌（健康活細(xì)菌到死細(xì)菌的過(guò)渡階段）。
活菌熒光單位計(jì)算公式：
AFU=N1×a×1000(AFU/mL(g))
AFU：活性熒光單位
N1：儀器統(tǒng)計(jì)活菌濃度(cells/ul)
a：樣品稀釋倍數(shù)
1000：是ul和ml間單位換算系數(shù)
報(bào)告結(jié)果說(shuō)明：采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)死活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，其結(jié)果以AFU/mL(g)為單位進(jìn)行報(bào)告。流式方法得到結(jié)果與經(jīng)典平板培養(yǎng)法測(cè)得的菌落形成單位CFU/mL(g)結(jié)果之間具有顯著的相關(guān)性。
??????? 細(xì)菌直徑比較小，建議FS和SS選擇對(duì)數(shù)放大模式。為減少雜信號(hào)的影響，可以通過(guò)FSC-A和FSC-H排除粘連體。
??????? 流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳酸菌的濃度時(shí)，需要將樣本濃度控制在1x106-107個(gè)/ml左右，確保流式檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
??????? 如遇細(xì)菌與背景噪音較難區(qū)分情況，可先通過(guò)核酸染料如SYTO圈出陽(yáng)性群體并設(shè)門(mén)。通過(guò)反射門(mén)方式在FSC和SSC圖中圈出主細(xì)菌群體。
??????? 由于PI的發(fā)射光譜較寬，最佳發(fā)射光617nm。流式檢測(cè)時(shí)，可選擇PE、ECD(620/30)或PerCP通道。建議首先ECD(620/30)或Percp通道，即可保障最佳的接收光，也可減少FITC通道信號(hào)溢漏，減少補(bǔ)償調(diào)節(jié)。
??????? 除了乳酸菌之外，流式細(xì)胞儀還可以被應(yīng)用于分析其他多種菌種的相關(guān)指標(biāo)，包括大腸桿菌、趨磁細(xì)菌、化膿性鏈球菌、球芽孢桿菌以及草生歐文氏菌等。利用流式細(xì)胞儀，可分析細(xì)菌濃度、評(píng)估細(xì)菌活力、鑒別種屬，并進(jìn)一步探究細(xì)菌群體分化情況等。
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