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應(yīng)用精要|OMIP-079：小鼠脾臟中CD4T和CD8T的幼稚/記憶亞型和Treg亞群的周期檢測

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方案背景：

細(xì)胞增殖與T細(xì)胞

細(xì)胞增殖的周期性是生物的一個(gè)基礎(chǔ)特征。同樣適應(yīng)性免疫的抗原特異性T和B細(xì)胞通過克隆擴(kuò)增產(chǎn)生大量短壽命的效應(yīng)細(xì)胞和一些長壽命的記憶細(xì)胞。T細(xì)胞主要有兩個(gè)亞群：輔助性CD4T細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8T細(xì)胞；隨著時(shí)間推移，記憶性CD4⁺T和CD8⁺T通過細(xì)胞死亡、存活和低水平的穩(wěn)態(tài)增殖來維持動(dòng)態(tài)的平衡。在穩(wěn)態(tài)條件下，未處理小鼠的脾臟中大多數(shù)T細(xì)胞是靜止細(xì)胞，有少部分細(xì)胞發(fā)生分裂，這可能和未知的環(huán)境抗原和/或細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的穩(wěn)態(tài)增殖有關(guān)。此外一些Treg細(xì)胞（CD4T細(xì)胞下的一個(gè)子集，表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3）具有激活/增殖表型，這反應(yīng)了成年小鼠的持續(xù)自我更新。

T細(xì)胞亞群

在C57BL/6小鼠中，記憶性T細(xì)胞高表達(dá)CD44，可與中/低表達(dá)CD44的幼稚（na?ve）T細(xì)胞區(qū)分。同樣的，在人類中可通過CD45RA的高表達(dá)或低表達(dá)將幼稚和記憶表型T細(xì)胞區(qū)分開。增殖潛能聯(lián)合淋巴結(jié)歸巢能力和效應(yīng)功能可進(jìn)一步區(qū)分記憶T細(xì)胞下不同亞型。中央記憶T細(xì)胞（CMT）也有幼稚T細(xì)胞表達(dá)的淋巴結(jié)歸巢受體CD62L，而效應(yīng)記憶T細(xì)胞（EMT）缺乏CD62L。人外周血T細(xì)胞最初使用CCR7，一種CCL19/CCL21的趨化因子受體作為標(biāo)記物區(qū)分TCM和TEM。T細(xì)胞的另一個(gè)亞型，TEMRA細(xì)胞是重新獲得幼稚表型的效應(yīng)記憶細(xì)胞，在人類中為CD45RA⁺，小鼠中為CD44^int/low。根據(jù)上述內(nèi)容，小鼠CD4T和CD8T中的四個(gè)幼稚/記憶T細(xì)胞亞型可被定義為：

Na?ve T：CD44^int/lowCD62L⁺

CMT：CD44^highCD62L⁺

EMT：CD44^highCD62L^-

TEMRA：CD44^int/lowCD62L^-

T細(xì)胞增殖與Ki67

準(zhǔn)確測量體內(nèi)T細(xì)胞的增殖程度對于跟蹤T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)反應(yīng)至關(guān)重要。小鼠T細(xì)胞增殖可通過Ki67標(biāo)記追蹤。Ki67是一種支持染色體結(jié)構(gòu)的核內(nèi)蛋白，其表達(dá)量與細(xì)胞增殖的活躍相關(guān)，且在細(xì)胞周期的G1、S、G2、M期有表達(dá)，而在靜止期（G0）幾乎不表達(dá)。核酸染料通過DNA的含量分析細(xì)胞周期的各個(gè)階段，如G0/G1期DNA含量為2N，S期為2N-4N，G2/M為4N。本文結(jié)合Ki67與DNA含量分析更細(xì)致劃分細(xì)胞周期不同階段，特別可區(qū)分2N DNA含量的中G0和G1期。2N DNA含量的Ki67⁺細(xì)胞可能是非積極增殖的G1期或由G1正返回G0期。

方案說明：本OMPI采用Ki67/DNA雙重染色技術(shù)，對小鼠脾臟CD4⁺和CD8⁺幼稚/記憶T細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞進(jìn)行離體細(xì)胞周期分析，區(qū)分G0、G1和S-G2/M期細(xì)胞。該方案適用于深入探索脾臟T細(xì)胞周期變化，尤其在T細(xì)胞亞群比例、數(shù)量和增殖狀態(tài)變動(dòng)的情境下，如老年小鼠記憶T細(xì)胞比例增高伴或不伴寡克隆擴(kuò)增、淋巴細(xì)胞減少癥小鼠的代償性T細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)基因小鼠Treg表達(dá)異常等。

方案詳情：

1??

樣本類型：小鼠脾臟

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試劑方案

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3??

圈門策略

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4??

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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使用手動(dòng)門控策略分析3個(gè)月大的C57BL/6J小鼠的脾臟細(xì)胞并通過5個(gè)步驟圈出活的脾臟單細(xì)胞：

A1. 通過Hoechst-33342-A vs Hoechst-33342-W圈出單DNA細(xì)胞；

A2. 通過Hoechst-33342-A在時(shí)間軸上的信號(hào)，圈出穩(wěn)定采集的事件，排除在壓力波動(dòng)情況下收集的事件；

A3. 使用FSC-A vs eFluor780圈出活細(xì)胞；

A4. 通過FSC-A vs SSC-A圈出“relaxed”門控，該門控包括高度激活和增殖的淋巴細(xì)胞；

A5. 通過Hoechst-33342-A vs Ki67 AF700-A雙參數(shù)圖排除在＞2n DNA群體中的Ki67int細(xì)胞，其他細(xì)胞為單細(xì)胞并用門控圈出作為后續(xù)分析的基礎(chǔ)。

B. 通過CD3-A vs Ki67-A雙參數(shù)圈出CD3⁺群體，該群體為CD3T細(xì)胞；在CD3T群體下通過CD4和CD8分別圈出CD4+群體（CD4T）和CD8+群體（CD8T）；在CD4T門控下通過Foxp3的表達(dá)識(shí)別出Treg群體（Foxp3⁺）和常規(guī)CD4T群體（Foxp3^-）；隨后在常規(guī)CD4T群體內(nèi)通過CD44和CD62L的表達(dá)定義幼稚/記憶亞群：CD44int/lowCD62L+(na?ve)、CD44highCD62L+(CM)、CD44highCD62L-(EM)和CD44int/lowCD62L-(EMRA)；在CD8T內(nèi)進(jìn)行同樣的圈門策略分析幼稚/記憶群體；

C. 在Hoechst-33342-A vs Ki67-A散點(diǎn)圖上分別分析Treg細(xì)胞和幼稚/記憶CD4T和CD8T的細(xì)胞周期：G0細(xì)胞為DNA 2n/Ki-（左下象限）；G1細(xì)胞為DNA 2n/Ki+（左上象限）；S-G2/M細(xì)胞為DNA＞2n/Ki67+（右上象限）。

?該OMIP利用Ki67/DNA雙染檢測幼稚/記憶CD4T和CD8T細(xì)胞及Treg細(xì)胞的細(xì)胞周期，與其他OMIP無相似之處。此方案有助于揭示不同條件下（如疫苗接種、感染、自身免疫病和癌癥等）被忽視的Treg及幼稚/記憶T細(xì)胞亞群的增殖和周期變化。